茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用刘惠芳吴继林！郝秉中儋州中国热带农业科学院橡胶栽培研究所农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室海南用对巴西橡胶树Mull.Arg）乳管分化的作用。将含这些激素的羊毛脂涂在巴西橡胶树无性系的萌条上，用光学显微镜技术检查茎中乳管数目的变化，以及次生韧皮部轴向系统的细胞层数。

　　施用茉莉酸对正在伸长的茎中初生乳管分化有明显促进作用，但不能诱导形成次生乳管。施用茉莉酸对已经停止伸长的茎中初生乳管的分化没有显著作用，但促进次生乳管的形成。对经过一个生长季节的萌条，施用茉莉酸能够促进各个伸长单位茎中次生乳管的分化。

　　单独施用不同浓度的6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、水杨酸、乙烯丰和脱落酸对乳管分化都没有显著影响。茉莉酸分别与不同浓度吲哚乙酸、水杨酸、乙烯丰共施后，与单独施用茉莉酸比较，对乳管分化没有显著影响8%茉莉酸和0.45 %6-苄基腺嘌呤同时施用比单独施用0.08%茉莉酸能诱导形成更多的次生乳管。0.08 %茉莉酸和0.53%0.0053%的脱落酸共施与单独施0.03%茉莉酸比较，诱导形成的次生乳管有减少趋势。

　　采用酶联免疫技术对巴西橡胶树茎中的异戊烯基腺嘌呤水平进行了初步测定，结果表明，橡胶树顶端伸长单位茎中异戊烯基腺嘌呤含量高于基部伸长单位。施茉莉酸后，无论是基部伸长单位还是顶部伸长单位，异戊烯基腺嘌呤的水平均低于对照，5d后明显上升，明显高于对照，然后趋于稳定。

　　6-苄基腺嘌呤脱落酸吲哚乙酸水杨酸乙烯丰异戊烯基腺嘌呤中图法分类号Q945.39巴西橡胶树的乳管是橡胶合成和贮存的地方，是决定橡胶产量*主要的结构成分，因此乳管分化的研究是天然橡胶生产技术开发的基础。过去人们对乳管的形态学、细胞学和胶乳的生理生化特性进行了比较深入的研究，但对乳管分化的机制和调控了解得很少。郝国家自然科学基金资助项目（39860013）刘蕙芳女，1972年生，植物学硕士。研究方向：花卉组织培养。现工作单位：湖北省农业科学院园艺工程技术中心。

　　通讯联系人。！期刘惠芳等：茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用7秉中等实验证明割胶可以促进乳管分化。后来的实验结果进一步表明，排胶在割胶促进乳管分化中起主要作用。

　　对A在植物防卫反应信号传递中的作用已进行了若干研究！7，8，结果表明A在受伤及其它胁迫反应信号传导中不是一个孤立的信号分子，脱落酸（Abscisicacid，ABA）、乙烯、系统素、寡糖素、水杨酸（Salicylicacid，SA）、电信号等都可能参与A的信号传递，共同调节相关基因的表达。因此推测A在促进巴西橡胶树乳管分化过程中也一定还有其它激素和信号分子的参与，协同调节控制乳管分化基因的表达。推测有关的激素，包括与胁迫反应高度相关的ABA、SA、乙烯，以及与细胞分裂、分化、伸长、膨大密切相关的细胞分裂素和生长素。它们和A是否对乳管分化具有协同作用，值得深入研究，以便进一步弄清A促进乳管分化的机制。

　　本研究将在外源A诱导橡胶树乳管分化的基础上，试验6-苄基腺嘌呤等5种激素与A共施对橡胶树乳管分化的作用。

　　1材料与方法1.1试验材料芽接苗种植于本院试验农场增殖苗圃。这些植株每年都被修剪。在修剪的植株上由潜伏芽长出萌条。

　　1.激素的溶解和来源所有激素均配成母液，然后按具体实验要求的浓度进行稀释，*后加到羊毛脂中搅拌均。生长素、ABA、SA和A都先溶于少量80%的乙醇，细胞分裂素溶于少量0.1mol/L的盐酸，然后用蒸馏水定容配成母液。化学物质的浓度用重量百分数表示。

　　茉莉酸（A）购于Sigma公司，脱落酸、细胞分裂素来源于Fluka公司，SA、IAA为国产，乙烯丰来自美国。

　　1.3各激素的施用方法将含有激素的羊毛脂涂施在每个伸长单位（后面）*下面一片叶着生处下面1cm的茎表面。对于1个伸长单位，每次大约涂用0.1g羊毛脂。涂羊毛脂时茎的表面保持原状态，或者先轻轻刮伤茎表面角质层后涂抹。涂羊毛脂后用小块塑料薄膜覆盖于处理的茎热带作物学报22卷表面处，处理50d后，在施羊毛脂处取树皮作为测定样品。！4光学显微镜的样品制备%的乙醇固定，并用含碘和溴的冰醋酸溶液进行处理。乙醇梯度脱水，正丁醇透明，石蜡包埋，切片用固绿染色。乳管中的胶乳由于碘溴处理后被染成棕色，因而在切片中能够清楚的识别。

　　5乳管和韧皮部的细胞测定用树皮横切面标本，在显微镜下对禚皮部组织进行观察统计。每个样品观察（个视野，测定值用平均数±标准差表示，或数据用国际通用生物软件SAS处理。

　　初生乳管数目“在树皮横切面600的切向宽度中，初生乳管的数目。

　　次生乳管列数目：在树皮横切面上0-5cm的切向宽度中，贯穿整个次生禚皮部的一行乳管计/列，不满一列的用小数表示。

　　禚皮部细胞层数：表示在次生禚皮部轴向系统中，径向细胞列的数目。它包括禚皮部薄壁细胞，乳管细胞和筛管细胞，但伴胞除外。这些细胞层的数目表示形成层纺锤原始细胞在形成禚皮部轴向系统时所分裂的次数。

　　16内源激素测定的采样及测定方法采样方法：在处理当天取样作为处理前对照，在处理后的第1，3，5，7，9d分别取样，每个样品设3个重复，采样部位为涂药的树皮，采样时先轻轻用棉花擦去羊毛脂。样品采集后立即用预冷的80%甲醇研磨，离心，取上清液保存于-30 "低温冰箱中，备测内源激素。内源激素测定：参照吴颂如等的方法提取，ELISA测定。

　　植物内源激素ELISA法的测定试剂盒购于南京农业大学植物生理学教研室，使用MB-I型酶联免疫检测仪测定OD值。

　　2.1橡胶树萌条的生长节律和乳管在茎中的分化橡胶树修剪后枝上的潜伏芽产生的萌条在一年中通常要萌发5次。每次萌发形成一个在形态上明显的部分，称为一个伸长单位（ExtensionUnit，简称EU）。每个伸长单位上部是一系列排列较紧密的叶，下部是一系列被较长的节间分开的鳞叶。一个伸长单位也称为一个叶蓬。在一个萌发周期中，茎的组织（包括乳管）随着茎的生长而逐渐分化。一个伸长单位经历的发育时期可以用叶蓬发育的状况来划分，在叶蓬处于古铜期时，幼叶呈紫色还未完全展开，这时茎正在伸长，茎中还没有次生禚皮部，因此仅有初生乳管。在叶蓬处于淡绿期时，茎的伸长已经完成，初生乳管的分化已经停止，同时次生禚皮部已经开始发育，但还没有次生乳管形成。在叶蓬处于稳定期时，虽然茎内已形成一些次生禚皮部，但是仍然没有次生乳管形成，总之，一个完成初生生长的伸长单位是没有次生乳管的。

　　在一个生长季节中，一个萌条通常形成5个伸长单位。在生长季节的末期，已形成的5个伸长单位从萌条顶端向下，茎的发育年龄逐渐增大，组织分化也有差别。在萌条的基部由于形成层活动的时间较长，次生禚皮部细胞层数较多，在基部2个伸长单位（EU4和EU5）已有次生乳管形成（表2）。由于茎中初生乳管的数目在伸长单位形成后不再增加，而茎在后来由于维管形成层的活动会不断增粗，结果在萌条基部的增粗较多的伸长单位中，茎的初生乳管的密度变小。

　　2.2单独施用A对乳管分化的作用A对不同发育时期的伸长单位茎中乳管分化的作用表1所列结果表明，古铜期的伸长单位施A，导致初生乳管的数目明显增加，外施A后历经50d取样时，形成层活动并形成次生禚皮部，但没有诱导次生乳管形成；淡绿期的伸长单位施'（，对初生乳管没有明显影响，但能诱导次生乳管的分化。

　　A处理对古铜期、淡绿期伸长单位茎中有功能禚皮部细胞层数没有明显影响。

　　处理时伸长单位发育时期处理初生乳管个数次生乳管列数韧皮部细胞层数古铜期淡绿期表1A对一个伸长单位不同发育时期茎中乳管分化的作用说明：每个处理10个标本；处理与对照间的差异显著水平：5 4，差异显著用不同的字母表示，差异不显著用相同的字母表示。

　　A对经过一个生长季节的萌条不同伸长单位茎中乳管分化的影响实验中A涂在刮角质层的茎上。由表2可见，刮角质层对茎的乳管和其它组织的分表2施用A对经过一个生长季节的萌条的乳管分化的作用比较项目部位正常萌条刮角质层+羊毛脂刮角质层+0.08%A初生乳管个数次生乳管列数韧皮部细胞层数说明：测定值=10个萌条的平均数±标准差。生长季节为化基本没有影响。与正常萌条比较，刮角质层萌条各个伸长单位初生乳管的密度和次生韧皮部细胞层数没有显著差别。刮角质层萌条各个伸长单位次生乳管的分化基本没有改变，即与正常萌条一样，在基部第！和第5伸长单位中有次生乳管分化，在其余伸长单位除了个别标本中出现少数次生乳管外，基本没有次生乳管分化。

　　施用A能够在第1至第5个伸长单位茎中诱导形成较多的次生乳管（图版I1-6）。施用对次生乳管分化的影响程度，在各个伸长单位之间差别不明显。对初生乳管密度和次生韧皮部细胞层数没有明显影响。

　　2.3A与BA对乳管分化的协同作用从表3可见，单独施用3种浓度的BA都不能诱导次生乳管的分化，对初生乳管密度也没有明显影响，但次生韧皮部细胞层数由于施BA而略有减少。A与不同浓度BA共同施用能够诱导次生乳管分化；A与高浓度BA（0.08%A与0.450BA）共同施用时能够比单独施用A诱导较多的次生乳管。A与BA共同施用对初生乳管密度没有显著影响。与单独施用BA?样，A和BA共同施用导致次生韧皮部细胞层数略有减少（图版表3A与BA对乳管分化的协同作用处理样本数次生乳管列数初生乳管个数韧皮部细胞层数羊毛脂说明：处理间比较，差异显著水平5 2.4A与引哚乙酸（Indole-3-aleticacid，IAA）对乳管分化的协同作用由表4可见，单独施用3种浓度的IAA不能诱导次生乳管分化，对于初生乳管的分化表4A与IAA对乳管分化的协同作用处理样本数次生乳管列数初生乳管个数韧皮部细胞层数羊毛脂说明：处理间比较，差异显著水平5也没有显著影响。当分别与不同浓度IAA共同施用时，能够诱导次生乳管分化，但与单独施用A比较没有显著差异。A与IAA共同施用时对初生乳管密度也没有显著影响。

　　与施用A比较，单独施用不同浓度的IAA和A分别与不同浓度的IAA共同施用，次生禚皮部细胞层数的变化没有明显规律。

　　2.5A与SA对乳管分化的协同作用从表看出，单独施用3种浓度的SA不能诱导次生乳管分化，对初生乳管密度和次生禚皮部细胞层数也基本没有影响，但高浓度SA（0.28%）处理使次生禚皮部细胞层数明显增多。

　　表5A与SA对乳管分化的协同作用处理样本数次生乳管列数初生乳管个数韧皮部细胞层数羊毛脂说明：处理间比较，差异显著水平5 %A与不同浓度SA同时施用能够诱导次生乳管分化，2种物质对次生乳管分化的作用与单独施用A比较没有明显差异。A与SA同时施用，与它们分别单独施用一样，对初生乳管密度和次生禚皮部细胞层数基本没有影响。

　　2.6A与乙烯丰对乳管分化的协同作用从表6可见，单独施用3种浓度的乙烯丰不能诱导次生乳管分化，对初生乳管密度没有影响，但使次生禚皮部细胞层数增加。

　　表6A与乙烯丰对乳管分化的协同作用处理样本数次生乳管列数初生乳管个数韧皮部细胞层数羊毛脂说明：处理间比较，差异显著水平5 %ETH：乙烯丰。

　　12热带作物学报22卷%A与不同浓度的乙烯丰同时施用能够诱导次生乳管分化，但是与单独施用A比较并无显著差别。2种激素同时施用对初生乳管密度和次生禚皮部细胞层数的作用，与单独施用乙烯丰比较没有明显差别。

　　2.7A与ABA对乳管分化的协同作用表7表明，单独施用ABA不能诱导次生乳管，对初生乳管密度和次生禚皮部细胞层数也没有明显影响。A与ABA共同施用诱导的次生乳管列数目比单独施用A少，但差异不显著。2种激素同时施用对初生乳管密度和次生禚皮部细胞层数没有明显影响。

　　表7A与ABA对乳管分化的协同作用处理样本数次生乳管列数初生乳管个数韧皮部细胞层数羊毛脂说明：处理间比较，差异显著水平5 2.8施A对橡胶树萌条顶端伸长单位（EU1）和第三伸长单位（EU3）内源异戊烯基用酶联免疫法测定萌条：PA<含量和施用A对它的影响，结果见。

　　从可见，EU1施用A后第1天iPAs含量立即明显下降，5d后升高，然后趋于稳定；EU3施用A后iPAs含量也有类似的变化，但含量显著下降发生的时间较迟。

　　+讨论+外源A对乳管分化的作用本研究证实了外源A能够促进巴西橡胶树茎中乳管分化。实验结果表明，对于萌条！期刘惠芳等：茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用13中刚完成初生生长不久的伸长单位，在正常情况下还没有次生乳管出现，但施用A后能够诱导次生乳管形成。在生长季末期，萌条已经形成个伸长单位的情况下，上部伸长单位仍然没有次生乳管分化，基部的两个伸长单位茎中已分化了若干次生乳管。这时施用A能够在上部伸长单位诱导形成次生乳管，并使基部伸长单位在原来正常分化次生乳管的基础上形成更多的次生乳管。施用A在促进乳管分化的同时并不显著影响茎中次生禚皮部细胞层数，这表明形成层的分裂频率活动并无明显变化。因此，施用！A仅增加了形成层纺锤原始细胞分化乳管的能力，也就是说A使形成层纺锤原始细胞分化乳管的比例发生了改变。

　　A对一个伸长单位不同发育时期茎中乳管分化的作用研究结果表明，在萌条的一个伸长单位形成时，在古铜期施用A对初生乳管的分化有明显的促进作用，但不能诱导形成次生乳管；在淡绿期施用A，对初生乳管分化没有明显影响，但能够诱导形成次生乳管。这种情况与橡胶树乳管分化的规律有关，同时也与外施A的有效性持续的时间有关。从芽萌动至古铜期，茎由于初生分生组织的活动而伸长和加粗，因为没有形成层出现，只可能分化形成初生乳管。这时施用A在当时就只能够促进初生乳管的分化；待到茎进一步发育出现形成层时，A的作用已经消失，也不可能诱导形成次生乳管。在淡绿期茎中初生生长已经停止，初生乳管分化已经完成，同时维管形成层出现，开始次生生长，因此这时施用！A已不能影响初生乳管分化，但能诱导形成层分化次生乳管。

　　3.3各种激素对乳管分化的作用5种激素对乳管分化的作用，这5种激素是：BA、IAA、SA、乙烯（试验中采用乙烯释放剂乙烯丰）和ABA.这些激素可以分成2组，一组是IAA和BA，它们是植物正常生长发育所需的，同时也参与植物对环境胁迫的反应。另一组是乙烯、ABA、SA，它们是植物对环境胁迫反应的关键信号分子，同时也参与植物的正常生长发育。实验结果表明，单独使用这种激素都不能诱导橡胶树萌条茎中乳管的分化。这进一步证明了A诱导巴西橡胶树乳管分化的特异性。BA等种激素不能诱导橡胶树萌条茎中乳管分化，当然并不能证明它们不参与乳管分化的调控。外施BA等种激素的实验结果表明，在此实验条件下，这种激素不是诱导乳管分化的关键信号分子。事实上已有实验证明这些激素（除了ABA）都参与一些植物的乳管或其它分泌结构的形成。Suri和Ramawa/012，135采用组织培养的方法，用萝摩科牛角属植物Poce"）的茎产生的愈伤组织作实验，发现这些愈伤组织分化乳管依赖于细胞分裂素，同时证明这种乳管分化也被生长素促进。此外，Fahn0195指出，许多植物的树脂道（它们和乳管一样属于分泌结构）能够被外源乙烯诱导。

　　3.4A与5种激素共施对乳管分化的协同作用如上所述，虽然A以外的许多激素不是诱导乳管分化的关键分子，但它们可能参与乳管分化的诱导。因此本研究试验了BA等5种激素分别与A同时施用对诱导乳管分化的作用。结果表明，BA与A共同施用能够加强A诱导乳管分化的作用，而ABA与A共同施用则减弱了A诱导乳管分化的作用。

　　BA是人工合成的激动素类似物。激动素在调节植物生长发育中起重要作用，特别是在控制细胞分裂中是一个绝对需要的分子。前面已提到萝摩科愈伤组织分化乳管依赖激动素，但作用机制还不清楚。在本研究中BA单独使用不能诱导乳管分化，但BA和A同时使用时，能使A诱导乳管分化的作用加强。已有实验证明，在烟草中具有较高激动素水平的植株在伤害的情况能积累较高水平的A.因此笔者推测橡胶树在外施A的同时施用较高浓度的BA会导致外源A诱导较多的内源A形成，结果将有利于乳管的分化。

　　外源A能够诱导形成内源A还未充分研究过，但已知外施A能诱导A生物合成的关键酶一脂氧合酶基因的表达。此外，根据笔者的测定，橡胶树萌条外施A后内源PAs含量发生变化，前5d比对照低，接着上升，然后趋于稳定。因此，假定A与BA同时使用可能补充了施A前期内源BA的不足，因而对形成层细胞分化乳管有利。

　　ABA和A不仅结构相似，还具有很多相同的生理作用%1/，它们都能抑制植物生长，促进植物衰老和叶片脱落，而且在植物对环境的胁迫反应中起重要作用。本研究中，外施A能够诱导巴西橡胶树萌条形成乳管但外施ABA则对乳管分化没有影响，在A和ABA共施的情况下，A诱导乳管分化的作用减弱，这个结果表明，在诱导乳管分化方面，A和ABA似乎有拮抗作用。

　　如果把外源A诱导乳管分化看成是植物体内A引发的防卫反应的一种表现，就能够进一步理解各种激素对乳管分化的作用。早先曾认为ABA是植物防卫反应的一个关键信号分子，但后来证明它并不参与伤害反应的信号传递途径%1（。这样可以看出，A和ABA生理作用的区别在于；A主要参与植物对生物胁迫的反应，即抗虫与抗病，但ABA主要参与植物对非生物胁迫的反应，如抗寒、抗旱、耐盐等。此外，A和SA的生理作用也是不同的，因为SA主要参与抗病反应，SA信号途径和A信号途径是互相独立的。至于乙烯，有证据表明它既参与植物对生物胁迫的反应，也参与植物对非生物胁迫的反应。由于A和ABA、SA和乙烯的这种差异，它们对乳管分化的作用不同是可以理解的。但是为什么A和ABA共同施用能够削弱A诱导乳管分化的作用，而A和乙烯共同施用不能促进A对乳管分化的诱导，有待进一步研究。

　　根据外施A能够诱导乳管分化，笔者曾提出橡胶树体内的A是调节形成层分化乳管的重要因子，同时推测A可能诱导已有乳管中橡胶和其它与防御有关的物质的形成%1.有关研究正在进行之中。

　　致谢谭海燕老师、符远飞和朱丽梅同学在实验中给与帮助，特此致谢！